II. Техника измерения электронных спектров поглощения и люминесценции. Спектральные свойства и характеристики хромофоров. Диаграмма Яблонского поглощение света. Закон Бугера Ламберта, бера

Уровнями S 1 → S 0 {\displaystyle S_{1}\rightarrow S_{0}} или триплетными T 1 → T 0 {\displaystyle T_{1}\rightarrow T_{0}} . Типичное время жизни такого возбуждённого состояния составляет 10 −11 −10 −6 с.

Флуоресценцию следует отличать от фосфоресценции - запрещённого по спину излучательного перехода между двумя состояниями разной мультиплетности. Например, излучательный переход возбуждённого триплетного состояния T 1 в основное состояние S 0 . Синглет-триплетные переходы имеют квантовомеханический запрет, поэтому время жизни возбуждённого состояния при фосфоресценции составляет порядка 10 −3 −10 −2 с.

Происхождение термина [ | код ]

Термин «флуоресценция» происходит от названия минерала флюорит , у которого она впервые была обнаружена, и лат. -escent - суффикс, означающий слабое действие.

История изучения [ | код ]

Впервые флуоресценцию соединений хинина наблюдал физик Джордж Стокс в 1852 году.

Теоретические основы [ | код ]

Схематическое изображение процессов испускания и поглощения света. Диаграмма Яблонского [ | код ]

Схематически процессы поглощения света и флуоресценции показывают на диаграмме Яблонского.

При нормальных условиях большинство молекул находятся в основном электронном состоянии S 0 {\displaystyle S_{0}} . При поглощении света молекула переходит в возбуждённое состояние . При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный подуровень состояния S 1 {\displaystyle S_{1}} . Однако, существуют и исключения: например, флуоресценция азулена может происходить как из S 1 {\displaystyle S_{1}} , так и из S 2 {\displaystyle S_{2}} состояния.

Квантовый выход флуоресценции [ | код ]

Квантовый выход флуоресценции показывает, с какой эффективностью проходит данный процесс. Он определяется как отношение количества испускаемых и поглощаемых фотонов. Квантовый выход флуоресценции может быть рассчитан по формуле

Φ = N e m N a b s {\displaystyle \Phi ={\frac {N_{em}}{N_{abs}}}}

где N e m {\displaystyle {N_{em}}} - количество испускаемых в результате флуоресценции фотонов, а N a b s {\displaystyle {N_{abs}}} - общее количество поглощаемых фотонов. Чем больше квантовый выход флуорофора , тем интенсивнее его флуоресценция. Квантовый выход можно также определить с помощью упрощённой диаграммы Яблонского , где Γ {\displaystyle {\Gamma }} и k n r {\displaystyle k_{nr}} - константы скорости излучательной и безызлучательной дезактивации возбуждённого состояния.

Тогда доля флуорофоров, возвращающихся в основное состояние с испусканием фотона, и, следовательно, квантовый выход:

Φ = Γ Γ + k n r {\displaystyle \Phi ={\frac {\Gamma }{\Gamma +k_{nr}}}}

Из последней формулы следует, что Φ → 1 {\displaystyle \Phi \rightarrow 1} если k n r Γ → 0 {\displaystyle {\frac {k_{nr}}{\Gamma }}\rightarrow 0} , то есть если скорость безызлучательного перехода значительно меньше скорости излучательного перехода. Отметим, что квантовый выход всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь.

Флуоресцентные соединения [ | код ]

Флюоресценция в ультрафиолетовом свете 0,0001 % водных растворов: голубым - хинина, зелёным - флуоресцеина, оранжевым - родамина-B, жёлтым - родамина-6G

К флуоресценции способны многие органические вещества, как правило содержащие систему сопряжённых π-связей. Наиболее известными являются хинин , метиловый зелёный, метиловый синий, феноловый красный, кристаллический фиолетовый, бриллиантовый синий кризоловый, POPOP, флуоресцеин , эозин , акридиновые красители (акридиновый оранжевый, акридиновый жёлтый), родамины (родамин 6G, родамин B) и многие другие.

Применение [ | код ]

В производстве красок и окраске текстиля [ | код ]

Флуоресцентные пигменты добавляются в краски , фломастеры , а также при окраске текстильных изделий, предметов обихода, украшений и т. п. для получения особо ярких («кричащих», «кислотных») цветов с повышенным спектральным альбедо в нужном диапазоне длин волн, иногда превышающим 100 %. Данный эффект достигается за счёт того, что флуоресцентные пигменты преобразуют содержащийся в естественном свете и в свете многих искусственных источников ультрафиолет (а также для жёлтых и красных пигментов, коротковолновую часть видимого спектра) в излучение нужного диапазона, делая цвет более интенсивным. Особой разновидностью флуоресцентных текстильных пигментов является оптическая синька , преобразующая ультрафиолет в излучение синего цвета, компенсирующее естественный желтоватый оттенок ткани , чем достигается эффект белоснежного цвета одежды и постельного белья . Оптическая синька применяется как при фабричной окраске тканей, так и для освежения цвета при стирке , в стиральных порошках . Аналогичные пигменты применяются и в производстве многих сортов бумаги, включая бумагу для повседневного офисного использования. В ней содержание пигмента с синькой, как правило, наибольшее.

В технике [ | код ]

В технические жидкости, например - антифризы , часто добавляют флюоресцентные добавки, облегчающие поиск течи из агрегата. В ультрафиолетовом свете подтёки такой жидкости становятся очень хорошо заметны.

В биологии и медицине [ | код ]

В биохимии и молекулярной биологии нашли применение флуоресцентные зонды и красители, которые используются для визуализации отдельных компонентов биологических систем. Например, эозинофилы (клетки крови) называются так потому, что имеют сродство к эозину , благодаря чему легко поддаются подсчёту при анализе крови .

Лазеры [ | код ]

Флуорофоры с высокими квантовыми выходами и хорошей фотостойкостью могут применяться в качестве компонентов активных сред лазеров на красителях.

В криминалистике [ | код ]

Отдельные флуоресцирующие вещества используются в оперативно-разыскной деятельности (для нанесения пометок на деньги, иные предметы в ходе документирования фактов дачи взяток и вымогательства. Также могут использоваться в химловушках)

Эта работа заняла первое место в номинации «лучшая обзорная статья» конкурса « »-2014.

Как известно, однажды свет был успешно отделен от тьмы . С тем, что такое тьма, еще предстоит разобраться. Пока наметились лишь некоторые перспективы в этом направлении в связи с изучением темной материи и темной энергии . А вот свет человечество давно и успешно изучает и использует, в том числе в качестве исследовательского «инструмента». Одно из направлений использования света в экспериментальных исследованиях связано с явлением флуоресценции. За последние тридцать лет использование различных методов, основанных на регистрации флуоресценции, в биологических и медицинских исследованиях стремительно возросло. Обусловлено это появлением как новых технических возможностей - в первую очередь компьютеров и лазеров, - так и широкого спектра доступных флуоресцирующих молекул и молекулярных комплексов. Словно микроскопические репортеры эти соединения сообщают нам особыми световыми сигналами о свойствах молекулярного мира, в котором они находятся. Флуоресцентная методология обеспечила решение многих принципиальных задач биологии и медицины. Благодаря высокой чувствительности и сравнительной безопасности она вытеснила многие традиционные методы, связанные с применением радиоактивных веществ. Методы флуоресцентного анализа используются как в фундаментальных исследованиях для получения новых знаний о живом, так и в прикладных работах в биотехнологии, медицинской диагностике, криминалистике и многих других областях. Что же представляют собой флуоресцентные репортеры? Какую информацию можно получить с их помощью из глубин микромира? Как эту информацию регистрируют и анализируют? Но прежде всего - что такое флуоресценция?

Флуоресценция: свечение, индуцированное светом

Некоторые вещества после поглощения света в определенном диапазоне длин волн начинают излучать свет в другом, более длинноволновом, диапазоне. Впервые это явление было описано как видимое изменение цвета растворов некоторых органических соединений и минералов при наблюдении не на просвет (в проходящем свете), а под углом к проходящему свету. Так, например, Дэвид Брюстер (Sir David Brewster) в 1833 году заметил, что при освещении белым светом зеленого спиртового раствора хлорофилла от него «отражается» красный свет. Позднее, в 1845 году, Джон Хершель (Sir John Herschel) описал подобные наблюдения - появление голубой окраски у бесцветного раствора сульфата хинина при облучении солнечным светом. В 1852 году Джордж Стокс (George Gabriel Stokes) обнаружил видимое на глаз свечение минерала флуорита при его облучении невидимым ультрафиолетовым излучением. Учитывая источник происхождения наблюдавшегося свечения, он назвал это явление флуор есценцией, как он отметил, по аналогии с термином опал есценция, описывающим явление дихроизма в опале. Важно отметить, что эти термины не только отражают «историю» своего происхождения, но, что более важно, обозначают разные физические явления. Флуоресценция - это излучение , возникающее в молекулах вещества под влияние света. Опалесценция - это рассеяние света, которое иногда сопровождается интерференцией.

По своей сущности флуоресценция является одной из разновидностей люминесценции . Этим термином описывают все явления излучения веществом, вызванного «возбуждением» молекул различными факторами. Так, например, в некоторых химических реакциях возникает хеми люминесценция. Хемилюминесценцию в биологических объектах называют био люминесценцией*. Есть вещества, которые испускают свет при возбуждении электрическим током (электро люминесценция), быстрыми электронами (катодо люминесценция), γ-излучением (радио люминесценция) и другие. В этом контексте флуоресценция относится к категории фото люминесценции.

* - Недавно на «биомолекуле» вышла замечательная статья, описывающая открытие нового типа биолюминесценции: « » . - Ред.

Способные флуоресцировать атомы, молекулы и молекулярные комплексы называют флуорофорами или флуорохромами . Обычно этими терминами пользуются как синонимами. Однако в ряде источников под флуорохромами понимают все виды флуоресцирующих молекул, а под флуорофорами - только флуоресцирующий компонент (группировку) крупной молекулы. В классической монографии Дж. Р. Лаковица используется только один термин - флуорофор, для всех типов флуоресцирующих веществ. С целью единообразия мы будем пользоваться этим термином. Отметим также, что в исследовательской практике ковалентно присоединенный к макромолекуле флуоресцирующий компонент принято называть флуоресцентной меткой , а свободный флуорофор - зондом . Применяемые в микроскопии флуорофоры традиционно именуют флуоресцентными красителями . Наконец, некоторые авторы стали использовать термин биосенсоры в отношение флуорофоров, используемых в биологических исследованиях.

Физическую природу флуоресценции удобно проиллюстрировать, пользуясь диаграммой, которую предложил польский физик Александр Яблонский в 1933 году, и которая носит его имя. На рисунке 1 представлена упрощенная форма этой диаграммы.

Рисунок 1. Диаграмма Яблонского , иллюстрирующая электронные процессы в молекулах-флуорофорах при поглощении квантов света. Горизонтальные линии - энергетические уровни электронов: S 0 - основное, невозбужденное состояние; S 1 - синглетное возбужденное состояние; 0–3 - квантованные подуровни; Т 1 , Т 2 - квантованные уровни триплетного возбужденного состояния. Стрелками показаны переходы электронов в разные энергетические состояния: П - поглощение света, Фл , Фосф - испускание флуоресценции и фосфоресценции, соответственно, ВК - внутренняя конверсия, ИК - интеркомбинационная конверсия, ВР - вибрационная релаксация.

При поглощении фотонов определенной энергии в молекуле флуорофора происходит переход электронов из «основного» (S 0) на один из подуровней «возбужденного» (S 1 , S 2 , ..., S n) состояния с более высокой энергией. Спин электрона при переходе не меняется, и поэтому эти уровни называют синглетными. «Возбужденное» состояние нестабильно, и электроны быстро возвращается на исходный энергетический уровень. Происходить это может несколькими путями. Три из них - безызлучательные квантовые переходы: внутренняя конверсия, интеркомбинационная конверсия и вибрационная релаксация . Два других сопровождаются излучением света - это флуоресценция и фосфоресценция . При внутренней конверсии энергия электрона уменьшается до минимального синглетного уровня. В ходе вибрационной релаксации, которая вызвана преимущественно взаимодействием с окружающими молекулами, поглощенная энергия может «рассеяться» в виде тепла до «основного» уровня. Интеркомбинационная конверсия приводит к уменьшению энергии электронов с изменением спина. Такое энергетическое состояние электрона называется триплетным. Флуоресценция возникает при переходе с нижнего синглетного уровня в «основное» состояние, а фосфоресценция - при переходе в «основное» состояние с триплетного уровня.

Отметим три важных обстоятельства.

• Во-первых, вероятности вышеотмеченных переходов различаются. Представление об этом дает сравнение времени, за которое осуществляется каждый из этих переходов, иными словами, время пребывания электронов в каждом из этих состояний (таблица 1). Чем меньше время, тем более вероятен данный переход. Очевидно, что флуоресценция и тем более фосфоресценция - маловероятные процессы. Это проявляется в сравнительно слабом свечении большинства флуорофоров даже при интенсивном облучении.
• Во-вторых, поскольку флуоресценция возможна при переходе электронов в «основное» состояние только с самого низкого синглетного уровня, то энергия излучения меньше поглощенной энергии. Поэтому спектр флуоресценции флуорофора всегда находится в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения.
• И, наконец, в-третьих, состояние электронов, участвующих в вышеуказанных процессах, зависит как от физических факторов окружающей среды, так и от общей электронной конфигурации молекулы. Именно это обстоятельство и делает флуорохром молекулярным репортером , который «на языке» флуоресценции сообщает о физико-химических условиях своего окружения.

«Язык» флуоресцентных репортеров

Флуоресценция характеризуется рядом параметров, которые меняются в зависимости от физического окружения или химической модификации флуорофора. Эти параметры и являются тем «языком», на котором передается информация от флуоресцентного репортера. Если продолжить аналогию, то сами параметры подобно словам приобретают конкретный смысл только при определенной их комбинации и в контексте. «Контекстом» для параметров флуоресценции являются условия их регистрации. Флуоресценция всех флуорофоров имеет пять ключевых характеристик: спектры поглощения и флуоресценции, а также квантовый выход, время жизни и анизотропия флуоресценции.

Каждый флуорофор имеет индивидуальные спектры поглощения и флуоресценции . Для иллюстрации на рисунке 2 представлены спектры Lyso Tracker TM Blue (Molecular Probes ®) и флуоресцеина. Основными параметрами спектров являются интенсивность флуоресценции, положение максимумов и так называемая полуширина (ширина спектра на уровне половины максимума). Часто именно эти параметры «информируют» об определенных свойствах окружения, в котором находится репортер. Так, в спектре флуоресценции многих флуорохромов возникают характерные изменения при разных рН среды. На рисунке 2 в качестве примера показана рН-зависимость спектра флуоресценции Lyso Sensor TM Yellow/Blue (Molecular Probes ®). Если такие изменения специфические, т.е. могут быть вызваны только сдвигами рН, то данный флуорофор может быть рН-репортером. Lyso Sensor TM Yellow/Blue является одним из таких репортеров.

Квантовый выход флуоресценции - это характеристика эффективности, с которой поглощенная энергия трансформируется в излучение по сравнению с процессами безызлучательной релаксации. Количественно квантовый выход определяется как отношение числа высвеченных фотонов к числу поглощенных. Чем больше квантовый выход, тем больше интенсивность свечения флуорофора. Часто этот показатель является решающим при выборе флуорофора на роль флуоресцентного репортера. Например, флуоресцеин имеет квантовый выход около 0.9, что и обеспечивает его широкое использование как в роли самостоятельного зонда, так и в качестве флуоресцентной метки нефлуоресцирующих молекул. Важно также и то, что этот показатель очень чувствителен к различным физико-химическим взаимодействиям репортера.

Время жизни флуоресценции - это усредненное время, в течение которого молекулы флоурофоров находятся в возбужденном состоянии перед испусканием фотонов флуоресценции. Измеряется этот показатель по затуханию флуоресценции после кратковременного возбуждения. Время жизни флуоресценции, с одной стороны, очень «чувствительно» к физико-химической «обстановке», в которой находится флуоресцентный репортер. С другой стороны, этот показатель является специфической характеристикой флуорофора, что позволяет получать «репортажи» от него в присутствии других флуоресцирующих молекул с похожими спектральными характеристиками.

Анизотропия флуоресценции - это количественная характеристика зависимости поляризации флуоресценции от поляризации возбуждающего света. По анизотропии можно судить о вращательной подвижности репортера и тем самым о вязкости среды в его микроокружении.

Пять вышеуказанных параметров флуоресценции являются непосредственно измеряемыми характеристиками излучения, которое «передают» репортеры. Однако информационные возможности флуоресцентных репортеров этим не ограничиваются. С флуоресценцией связан ряд явлений, которые используются в качестве методических «ухищрений» для получения той или иной информации от флуоресцентных репортеров.

Так, например, существует явление безызлучательной (резонансной) передачи энергии (БПЭ) от одного флуорофора на другой. При этом интенсивность флуоресценции у донора энергии уменьшается, а у акцептора возрастает. Происходить это может между флуорофорами с определенными спектральными свойствами и, что особенно важно, если они находятся на достаточно близком расстоянии. БПЭ лежит в основе многих методических подходов, позволяющих выявлять взаимодействие молекул. Определение эффективности безызлучательной передачи энергии позволяет даже оценивать расстояние между молекулами. В связи с этим БПЭ иногда называют «молекулярной линейкой» (см.: « » ).

Ряд методических возможностей базируется на тушении флуоресценции. Тушение может быть вызвано физическим взаимодействием флуорофора с молекулами-тушителями - такими, как кислород, галогены, амины, а также некоторые «электрон-дефицитные» органическими молекулы. В этом случае флуоресцентный репортер может «сообщать» о присутствии в его окружении определенных «тушителей».

Тушение флуорофора может происходить также за счет фотообесцвечивания под влиянием излучения большой интенсивности. В большинстве случаев с точки зрения регистрации флуоресценции это негативное явление. Однако «в умелых руках» это явление используется как специальный методический прием. Широкое распространение в изучении вязкости и/или диффузионных свойств цитоплазмы клеток получила методика восстановления флуоресценции флуорофора после фотообесцвечивания. Сущность ее заключается в том, что в небольшом участке клетки, содержащей флуорофор, производится его обесцвечивание кратковременной мощной вспышкой лазера. Затем регистрируется восстановление флуоресценции в том же участке, что обусловлено диффундирующими из других областей клетки не обесцвеченными молекулами флуорофора. По динамике этого процесса и характеризуют диффузионные свойства цитоплазмы.

Флуоресцентные репортеры, какие они?

Способностью флуоресцировать обладают многие вещества с определенными конфигурациями электронов. Такие конфигурации складываются в некоторых атомах, молекулах и надмолекулярных комплексах. Однако требуются специальные исследования для выявления потенциальной «способности» флуорофора выступать в роли молекулярного репортера для биологических и медицинских исследований. «Способности» эти оцениваются по специфичности информации, которую они передают, их стабильности, в первую очередь фотостабильности, в ряде случаев учитывается токсичность для отдельных клеток или организма. Особенностью флуоресцентных «корреспондентов» является их высокая индивидуальная «специализация». «Специализация» каждого репортера характеризуется по взаимодействию с определенными компонентами биологической системы, а также по специфичности флуоресцентных сигналов. Условно можно выделить две группы репортеров, созданных на основе органических и неорганических флуорофоров.

Органические молекулы-флуорофоры представляют наиболее многочисленную и разнообразную группу флуоресцентных репортеров. Как велико это разнообразие, можно оценить, заглянув в каталог фирмы Molecular Probes , специализирующейся на разработке и производстве флуорофоров c 1975 года. Это уже одиннадцатое издание (обновление) каталога (на момент написания статьи), что свидетельствует о высоких темпах развития данной области.

Большое разнообразие органических флуоресцентных репортеров обусловлено широким спектром задач и условий их применения. При выборе или при разработке репортеров принимаются во внимание информация, которую нужно получить, спектральные свойства флуорофора, а также специальные условия, связанные с особенностями исследуемой системы. Проиллюстрируем это на примере флуоресцеина и его производных (рис. 4). Как уже отмечалось, этот флуорофор имеет высокий квантовый выход и, соответственно, яркую флуоресценцию. Он может выступать в роли репортера рН. Однако, например, для измерения рН внутри клеток он не подходит, т.к. не проникает через цитоплазматическую мембрану. Его «доставка» в клетки может быть осуществлена с использованием гидрофобного производного - флуоресцеиндиацетата, который утратил способность флуоресцировать, но может проникать через гидрофобный барьер цитоплазматической мембраны. В клетках эстеразы отщепляют ацетильные группировки, и флуоресцеин оказывается в клетках. Аналогичным образом доставляется в клетки дихлорфлуоресцеин, т.е. через эстерифицированное производное. Этот репортер служит для регистрации наличия в клетках активных форм кислорода. Введение изотиоцианата в молекулу флуоресцеина дает возможность присоединять флуорохром к аминогруппам не флуоресцирующих молекул. С использованием флуоресцеинизотиоцианата создаются высокоспецифичные флуоресцирующие белковые репортеры - различные антитела, стрептавидин (реагент на биотин), а также нуклеотиды и олигонуклеотиды. Наконец, 5-карбоксиметокси-2-нитробензиловый эфир флуоресцеина (не показан на рис. 4) представляет собой не флуоресцирующее производное, которое может превращается в обычный флуоресцеин при облучении светом с длиной волны 355 нм. Это пример фотоактивируемых флуорофоров, флуоресцентные свойства которых как бы «спрятаны» (англ. «caged») до облучения.

Рисунок 4. Структурные формулы флуоресцеина и некоторых его производных.

В семидесятых годах ХХ века сотрудник Принстонского университета (США) Осаму Симомура (Osamu Shimomura ) при изучении биолюминесценции медузы Aequorea victoria выделил два белка, участвующих в этом процессе. Он установил, что при взаимодействии ионов кальция с одним из выделенных белков возникает хемилюминесценция голубого цвета. При этом второй белок может поглощать голубой свет и флуоресцировать зеленым светом, что придает зеленоватый оттенок свечения медузы. Первый белок был назван экворином, второй зеленым флуоресцентным белком (ЗФБ). С этого момента начинается история одной из самых успешных разработок молекулярной биологии, а ее основные герои - Осаму Симомура, Мартин Чалфи (Martin Chalfie ) и Роджер Тсьен (Roger Tsien ) в 2008 году были удостоены Нобелевской премии в области химии за открытие и подробное изучение ЗФБ . Чем же так замечателен этот белок?

После открытия ЗФБ начались интенсивные исследования его структуры, был синтезирован и клонирован соответствующий ему ген. Кроме того у некоторых морских беспозвоночных (Hydrozoa и Anthozoa ) были обнаружены аналогичные флуоресцирующие белки, структура которых также была охарактеризована. Все это позволило с помощью методов молекулярной биологии целенаправленно конструировать гены, кодирующие модифицированные формы ЗФБ с широким диапазоном спектральных характеристик, а также такие фоторегулируемые варианты, свечение которых можно «включать и выключать» путем облучения ультрафиолетовым излучением. В настоящее время можно говорить о том, что на основе ЗФБ создана и продолжает увеличиваться целая «армия» разнообразных флуоресцентных белков (ФБ) . Возможность применения ФБ показана в исследованиях многих видов клеток от бактерий до млекопитающих.

Несколько «скромнее» по сравнению с ЗФБ пока выглядит «судьба» экворина. Его структура также была установлена, и синтезирована ДНК, кодирующая этот белок. Изучение зависимости хемилюминесценции экворина от ионов кальция позволило разработать методики измерения концентрации катиона в некоторых клетках. Для измерения содержания ионов кальция внутри клеток существуют и флуоресцентные репортеры, в том числе производные ФБ. Однако достоинством хемилюминесцентного метода с использованием экворина является отсутствие необходимости возбуждающего флуоресценцию облучения, которое не всегда является безвредным для биологической системы, да и для флуорофоров, свечение которых при длительном облучении ослабляется (эффект фотообесцвечивания). Экворин относят к сравнительно большой группе так называемых люциферинов - веществ, ответственных за био(хеми)люминесценцию у некоторых морских и наземных организмов. Изучение люциферинов представляет интерес не только с целью их практического применения. Ведь до сих пор не известно, зачем биологических объектам вообще нужна биолюминесценция.

В последние годы заметно возрос интерес к созданию флуоресцентных репортеров на основе неорганических флуорофоров путем формирования так называемых биоконъюгатов, т.е. их комплексов с некоторыми органическими соединениями и/или с биологическими молекулами. Многие атомы, например, переходные металлы, лантаниды (точнее их ионы, например, Tb 3+ и Eu 3), кластеры из нескольких атомов золота и серебра после образования таких комплексов приобретают способность к сенсибилизированной флуоресценции. Сущность явления заключается в том, что энергия света, поглощенного органическим соединением, передается на атом неорганического элемента, который и излучает флуоресценцию. Важным свойством этого процесса является то, что молекулы-доноры энергии передают ее от электронов, находящихся в триплетном состоянии. Поэтому излучение неорганических флуорофоров в таком комплексе является «замедленным» по сравнению с «обычной» флуоресценцией, поскольку время жизни электронов в триплетном состоянии заметно больше, чем в синглетном (см. табл. 1). Кроме того, спектры флуоресценции неорганических биоконъюгатов имеют небольшую ширину и сильно сдвинуты относительно спектров поглощения. Сенсибилизированная флуоресценция репортеров-биоконъюгатов делает их «полезными» с точки зрения техники регистрации излучения. Так, в частности, они используются в условиях, когда в исследуемой системе имеется «обычная» флуоресценция других компонентов в том же диапазоне длин волн.

Особое место в этой группе занимают репортеры-биоконъюгаты, в которых в качестве флуорофора используются полупроводниковые кристаллы размером 2–10 нм (нанокристаллы), получившие название квантовых точек * (англ. quantum dots ). Квантовые точки, как правило, состоят из пары элементов III/V (например, CdS, CdSe, ZnS) или II/VI групп (например, GaN, InP, InAs). Вследствие малых размеров полупроводниковых кристаллов (в них всего 10–50 атомов!) для их электронов создаются условия квантованных энергетических переходов, подобных тем, что существуют в отдельных атомах. (Квантовые точки иногда даже называют «искусственными атомами»). Причем энергия этих переходов, а тем самым и длина волны флуоресценции, зависят от размера кристалла. Чем меньше кристалл, тем больше энергия излучения, т.е. меньше длина волны флуоресценции (рис. 5). Это свойство открывает возможность создания квантовых точек, имеющих практически любую спектральную конфигурацию. К этому следует добавить, что они, по сравнению с органическими флуорофорами, обладают еще и более высоким квантовым выходом и фотостабильностью. На рис. 6 показаны примерные размеры различных флуорофоров-репортеров.

* - Кого заинтриговало это название, прочтите подробную статью « » . - Ред.

Рисунок 5. Флуоресценция коллоидных растворов квантовых точек разного размера.

Биоконъюгаты на основе квантовых точек состоят из ядра (например, CdSe), покрытого слоем полупроводникового материала (например, ZnS), выполняющего «защитную» функцию, и лиганда - какого-нибудь органического вещества, обеспечивающего растворимость и/или присоединение биологических молекул.

Рисунок 6. Относительные размеры флуоресцентных репортеров. Для сравнения показан также белок иммуноглобулин G (Ig G).

Биоорганическая оболочка биоконъюгата обеспечивает его стабильность как коллоидной частицы и формирует «задание» репортера, его целевое назначение: где и с чем провзаимодействовать, какую «собрать и передать» информацию. При этом, конечно, размеры репортера на основе квантовой точки могут существенно увеличиться (на рис. 6 показаны приблизительные размеры квантовых точек без «снаряжения» биоконъюгата). В биоорганическую оболочку могут быть включены низкомолекулярные соединения - такие как биотин - и высокомолекулярные: одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды) и белки, в том числе ферменты и антитела (Ig G).

Инструменты для «чтения» флуоресцентных репортажей

В списке инструментов для получения и анализа «сообщений» флуоресцентных репортеров исторически первым является наш глаз. С его помощью можно проводить визуальные наблюдения флуоресцентного свечения на макроскопических объектах непосредственно, а на микроскопических - с помощью флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа. Примером макроскопических объектов могут служить колонии микроорганизмов, в которых экспрессированы ФБ, хроматограммы и электрофореграммы с применением флуоресцентных красителей. А в «обычный» флуоресцентный микроскоп (о «необычных» микроскопах чуть дальше) чаще всего заглядывают для выявления иммунологических реакций с использованием меченных флуорофорами антител, а также в некоторых исследованиях на уровне единичных клеток. Однако возможности зрительного анализа существенно ограничены в основном качественной оценкой «сигналов» флуоресцентных репортеров: «есть свечение -нет свечения» в определенной области образца. Гораздо больше информации можно получить, если «читать и расшифровывать» флуоресцентные «репортажи» по количественным характеристикам свечения (см. раздел «Язык» флуоресцентных репортеров ).

Для количественной характеристики флуоресценции необходимы измерения с использованием специальных приборов и определенной методологии. Условно можно выделить две методологии измерений параметров флуоресценции. Первая служит для измерения различных характеристик флуоресценции в сравнительно большой (макроскопической) области объекта, что обеспечивает получение интегральных (усредненных ) характеристик флуоресценции по объекту: раствору, суспензии коллоидных частиц, клеток, субклеточных частиц и т.п. Вторая методология ориентируется на измерения на уровне единичных микроскопических объектов - в первую очередь клеток и субклеточных частиц.

Измерения интегральной флуоресценции проводят с помощью спектрофлуориметров (флуоресцентных спектрофотометров) и планшетных флуориметров (англ . plate readers). Спектрофлуориметры - это, как правило, аналитические приборы, на которых можно получить все основные характеристики флуоресценции. Планшетные флуориметры - это устройства, рассчитанные на массовые анализы большого количества образцов (стандартные планшеты рассчитаны на 96, 384 или 1536 образцов). Измерения в них осуществляются по нескольким фиксированным характеристикам - например, по интенсивности флуоресценции в определенной спектральной области. Недавно появились планшетные флуориметры с возможностью измерения параметров затухания флуоресценции и тем самым оценки времени жизни флуорофоров в возбужденном состоянии. Большинство методик с использованием планшетных флуориметров основано на иммунологических реакциях или на анализе развития культур клеток в монослоях.

Методология измерений флуоресценции единичных микроскопических объектов также имеет два варианта. Первый основан на получении цифровых изображений флуоресцирующих микрообъектов (англ . fluorescence imaging) с последующим их компьютерным анализом (англ . computer image analysis). Второй - на «поштучном» измерении флуоресценции микрообъектов в потоке при прохождении через узкий капилляр специального прибора - проточного цитометра (англ . flow cytometer).

Цифровые изображения флуоресцирующих микрообъектов получают с использованием флуоресцентной микроскопии, которая недавно пережила настоящую техническую революцию. Так, в частности, наряду со стандартными флуоресцентными микроскопами, существенно усовершенствованными цифровыми фотокамерами и компьютерами, разработаны принципиально новые устройства. Это прежде всего так называемые конфокальные микроскопы (рис. 8). В конфокальном микроскопе возбуждение и регистрация флуоресценции осуществляются через микроскопическое отверстие, отсекающее «лишнее» свечение, которое возникает вне фокуса объектива. Путем сканирования этим «оптическим зрачком» в горизонтальной и/или вертикальной плоскости, регистрации сигналов фотоумножителем и обработки компьютером получается пространственное изображение флуоресцирующего объекта. Такая конструкция прежде всего позволяет получать более четкие по сравнению со стандартными микроскопами двумерные и трехмерные изображения. Кроме того, на современные конфокальных микроскопах можно проводить измерения параметров затухания флуоресценции.

Рисунок 7. Конфокальный микроскоп.

Еще один тип «революционных» микроскопов функционирует... вопреки основным физическим принципам флуоресценции. Возбуждение атомов в них осуществляется светом с длиной волны больше длины волны флуоресценции... (см. раздел Флуоресценция: свечение, индуцированное светом ). На самом деле основные законы физики при работе этих микроскопов не нарушаются. Просто при достаточной интенсивности светового потока с длиной волны больше длины волны возможной флуоресценции в один и тот же атом одновременно могут «попасть» два фотона, поглощенная электронами энергия удваивается, и ее оказывается достаточно для возбуждения флуоресценции. Поэтому такие микроскопы называются двухфотонными . Одновременное «попадание» двух фотонов в один атом - явление сравнительно маловероятное, и может происходить только там, где световой поток максимально сконцентрирован, т.е. в фокусе объектива. Это и обеспечивает высокое разрешение флуоресцентных изображений. К достоинствам, отличающим двухфотонные от других микроскопов, относится также их способность регистрировать флуоресценцию в образцах на глубине до 1,5 мм (есть сообщения о проникновении и на большую глубину), а также возможность существенно уменьшить неблагоприятное действие возбуждающего излучения как на исследуемые объекты, так и на флуоресцентные репортеры.

Специальные аналитические приемы (так называемая флуоресцентная корреляционная спектроскопия) позволяют использовать конфокальную и двухфотонную микроскопию для исследования движения единичных (!) флуоресцирующих молекул.

Однако «на вершине» современной оптической микроскопии по разрешающей способности стоят так называемые «наноскопы», то есть микроскопы, позволяющие различать на изображении флуоресцирующие объекты, расстояние между которыми составляет несколько нанометров. Существует два типа таких устройств. Первый основан на сканировании образца двумя узкими пучками лазерного излучения. Оптические свойства их подобраны так, что один возбуждает флуоресценцию в «нужной» области, а другой подавляет ее в рядом лежащей «ненужной» области. Размер же «нужной» области может быть порядка нескольких нанометров. Этот метод получил название STED-микроскопия .

Принцип работы второго типа наноскопов опирается на возможность оптического «включения и выключения» флуоресценции отдельных флуорофоров. Получают изображение одного и того же образца несколько раз, включая то одни, то другие молекулы. Затем компьютер «накладывает» изображения друг на друга, и на суммарном изображении можно увидеть свечение каждой из близлежащих молекул. В «обычном», пусть даже и конфокальном, микроскопе они слились бы одно светящееся пятно. Такой подход назвали PALM-микроскопией .

Флуоресцентные «репортажи», зарегистрированные в виде цифровых изображений, «расшифровывают», то есть извлекают количественную информацию с помощью специальных компьютерных программ анализа изображений. Так можно измерять интенсивность флуоресценции и ее пространственное распределение, оценивать спектральные характеристики излучения (псевдоспектральный анализ), определять количество флуоресцирующих частиц (например, клеток), характеризовать временные и поляризационные параметры флуоресценции.

Следует отметить также и эстетическую информативность флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные репортеры на микрофотографиях открывают нам чарующий мир причудливого сочетания цвета и форм (см. рис. 8). Фирмы-производители микроскопов Nikon и Olympus даже проводят ежегодные конкурсы фоторабот о микромире в свете флуоресценции. С галереями работ-победителей в этих конкурсах можно познакомиться на сайтах Olympus BioScapes и Nikon Small World .

Рисунок 8. Флуоресцентные микрофотографии с галереи ежегодного конкурса Nikon Small World. 1. Фибробласты мыши. 2. Веслоногий рачок Temora longicornis . 3. Митоз в клетках легких тритона. 4. Клетки глии мозжечка мыши in vivo (двухфотонная флуоресцентная микроскопия).

В отличие от флуоресцентных микроскопов, проточные цитометры не дают возможности полюбоваться флуоресцирующими объектами. Как правило, это суспензии клеток, в которых находятся флуорофоры. Сильная сторона проточных цитометров - скорость регистрации сигналов от единичных объектов. Обычный коммерчески доступный цитометр позволяет измерять флуоресцентные сигналы от клеток со скоростью 1000 клеток в секунду, а специализированные высокопроизводительные - до 25000 клеток в секунду! Стандартный вариант работы предусматривает измерение у каждого объекта от двух до десяти параметров: светорассеяния и флуоресценции одного или нескольких флуорофоров. Измерения на большом массиве объектов позволяют получать статистически достоверные результаты при исследовании гетерогенности клеточных, в частности, микробных популяций.

Наряду с обычными проточными цитометрами существуют приборы, которые способны физически разделять (сортировать) клетки по определенным параметрам светорассеяния или флуоресценции. Это открывает возможность дальнейшего изучения определенных субпопуляций с использованием других методов.

О чем «сообщают» флуоресцентные репортеры

Как уже отмечалось (см. раздел Флуоресцентные репортеры ), все флуоресцентные репортеры имеют «специализацию», т.е. способны избирательно характеризовать определенные свойства биологической системы. Остановимся вкратце на некоторых категориях «специалистов».

С помощью ряда флуоресцентных репортеров можно следить за ферментативным катализом . Как правило, это органические флуорофоры. Так, например, создают субстраты с ковалентно присоединенными флуорофорами, которые начинают флуоресцировать только после высвобождения в ходе реакции. Это и служит «сообщением» о ходе ферментативного катализа. Другой прием - использование «профлуорофора», который становится флуоресцентным в результате взаимодействия с продуктом реакции. С помощью флуоресцентных репортеров ферментативных реакций исследуют динамику процессов, а также их локализацию в клетках, тканях, органах и т.п.

Репортеры, сформированные на основе антител, «информируют» о протекании иммунологических реакций . Они представляют собой физические комплексы или ковалентные соединения флуорофоров с антителами (иммуноглобулинами). В качестве флуоресцирующего компонента показана возможность использования всех известных органических и неорганических флуорофоров, включая квантовые точки. Кроме того, к антителам можно присоединять ферменты, катализирующие реакции с образованием флуоресцирующего продукта. С помощью иммунологических флуоресцентных репортеров выявляют наличие в образцах определенных белков-антигенов, а также их локализацию. Так, например, показанные на рисунке 8 (фото 1) микрофибриллы в фибробластах мышей выявлены с помощью флуоресцентных антител.

Много видов информации можно получать с использованием ФБ. Разработаны методы создания генов гибридных белков, содержащих ФБ в качестве флуоресцирующей метки какого-нибудь естественного белка или даже нуклеиновой кислоты. Введение в клетки генов таких «гибридов» позволяет по флуоресценции определять «адреса» локализации молекулярных компонентов живых клеток , следить за динамикой их синтеза и перемещений. Существует рН-зависимость флуоресценции ФБ-содержащих гибридных белков, что используется для измерения внутриклеточного рН . Преимуществом таких рН-репортеров по сравнению с другими рН-чувствительными органическими флуорофорами является возможность измерений рН внутри различных внутриклеточных отделов (органелл), куда «адресован» основной компонент «гибрида».

Особый интерес вызывает применение различных ФБ в сочетании с методиками измерения флуоресценции, основанными на БПЭ. Для изучения взаимодействия или совместной локализации в клетках каких-нибудь двух белков к ним присоединяют два ФБ, подобранных так, чтобы при их сближении был возможен эффект БПЭ. Похожим образом можно изучать конформационные (структурные) изменения в белках. С этой целью соответствующие ФБ присоединяют к разным участкам белковой молекулы. Появление эффекта БПЭ свидетельствует о сближении ФБ и тем самым о конформационных перестройках в исследуемом белке. На этом же принципе работает «конструкция» из трех белков, которая используется как индикатор содержания ионов Са 2+ в живых клетках . В нее входят два ФБ и Са 2+ -связывающий белок кальмодулин между ними. При связывании Са 2+ конформация кальмодулина изменяется, ФБ сближаются и дают сигнал БПЭ. Здесь уместно заметить, что для регистрации ионов Са 2+ внутри клеток существуют и «простые» органические флуоресцентные репортеры. Белковые же репортеры могут быть более точно «адресованы» в определенные внутриклеточные компоненты либо с помощью микроинъекций, либо путем включения в структуру белка с определенной внутриклеточной локализацией.

Чувствительность флуоресценции к физическим свойствам микроокружения, в котором находится молекулы флуорофоров, позволяет использовать некоторых из них в качестве репортеров различных параметров внутриклеточной среды. Измерение внутриклеточной вязкости основано на зависимости поляризации флуоресценции от вращательной диффузии репортеров. Благодаря специально отобранным репортерам удалось измерить вязкость цитоплазмы внутри некоторых органелл, а также в гидрофобном слое биомембран. Взаимодействие некоторых флуорофоров с биологическими мембранами зависит от разности электрических потенциалов на них. С помощью таких репортеров получают сведения о величине мембранного потенциала . Для измерения внутриклеточной температуры разработано несколько вариантов флуоресцентных репортеров на основе лантанидов, квантовых точек, термочувствительных полимеров и органических флуорофоров. Наиболее впечатляющие результаты получены от специально сконструированных органических флуорофоров, которые способны «сообщать» температуру в различных частях клеток, «зашифрованную» в динамических параметрах затухания флуоресценции.

Что нового о микромире мы узнали благодаря флуоресцентным репортерам?

Флуоресцентные репортеры долго и успешно «служат» экспериментальной биологии и медицине. Только перечисление различных вариантов их применения могло бы составить объем не одной статьи. Однако есть такие области, где они сыграли ключевую роль в изучении принципиальных свойств и явлений биологических систем. Отметим некоторые из них для иллюстрации.

С использованием флуоресцентных репортеров была экспериментально доказана модель жидкокристаллической структуры всех биологических мембран* . Согласно этой модели, при структурной целостности и обеспечении барьера проницаемости для гидрофильных веществ биологическая мембрана достаточно «жидкая», чтобы в ней могли перемещаться «по назначению» ее отдельные компоненты. Такое представление о биологических мембранах позволяет понять основные молекулярные механизмы их функционирования, а также свойства живых клеток в целом.

* - В том числе благодаря флуоресцентным техникам было установлено, что мембрана является не просто пассивным «морем» фосфолипидов, в котором плавают «острова» мембранных белков, а полноправным участником множества важнейших биофизических процессов: « » . - Ред.

Механизмы трансформации энергии в клетках также стали понятны в значительной мере благодаря информации от флуоресцентных репортеров. Особую роль здесь сыграли флуорофоры, позволяющие регистрировать внутриклеточный и внутримитохондиральный рН*, а также разность электрический потенциалов на мембранах. С их помощью прежде всего был выявлен механизм сопряжения энергодонорных реакций окисления с энергозатратным синтезом аденозинтрифосфата (АТФ) - универсального донора энергии для большинства метаболических процессов. Кроме того, была изучена природа накопления различных веществ в цитополазме и в клеточных органеллах за счет мембранного электрического потенциала и градиента рН.

* - об устройстве флуоресцентного pH-сенсора см. статью « » . - Ред.

Жизнедеятельность клеток обеспечивается совокупностью скоординированных в пространстве и времени биохимических реакций. Эта координация осуществляется за счет специфического взаимодействия компонентов так называемых сигнальных систем. Основные компоненты этих систем были изолированы и охарактеризованы с помощью методов традиционной биохимии и молекулярной биологии. Однако только с появлением подходов, основанных на применении флуоресцентных репортеров, стало возможным получать сведения о пространственно-временной организации сигнальных путей непосредственно в клетках. Так, в частности, можно в реальном времени следить за пространственной динамикой взаимодействия белков-компонентов сигнальных систем. Это позволяет изучать распространение, усиление и интеграцию сигналов в клетках. Более того, стало возможным на уровне единичных клеток оценивать динамику экспрессии генов, что позволяет подойти к развитию концепций клеточной индивидуальности в противовес традиционным статистическим подходам. Следует отметить также и то, что с помощью флуоресцентных репортеров удалось обнаружить неизвестные ранее сигнальные компоненты. Например, была выявлена принципиальная роль ионов Са 2+ как сигнального посредника во многих регуляторных реакциях.

Во второй половине прошлого века в микробиологии возникла проблема, которую окрестили «великой аномалией учета микроорганизмов с помощью чашек Петри». «Виновниками» оказались флуоресцентные репортеры, два красителя нуклеиновых кислот - акридиновый оранжевый и 4,6-диамидино-2-фенилиндол. В многочисленных исследованиях природных образцов постоянно обнаруживалось несоответствие между данными о содержании микроорганизмов, полученными путем учета по колониям размножающихся клеток на чашках Петри, и данными прямого подсчета микроорганизмов, прокрашенных флуоресцентными красителями нуклеиновых кислот, с помощью микроскопии. Флуоресцентные репортеры всегда выявляли значительно больше микроорганизмов, чем анализ с чашками Петри. Для объяснения этих данных были выдвинуты две гипотезы. Согласно первой, часть клеток может находиться в некотором состоянии «покоя» и не размножается на чашках Петри. Согласно второй, условия культивирования (состав среды, температура и др.) не соответствуют «потребностям» некоторой части популяции для размножения. Проверка этих гипотез показала, что обе эти возможности могут реализовываться. Более того, был дан толчок к формированию двух новых больших направления исследований.

Первое связано с изучением так называемого «жизнеспособного, но некультивируемого состояния микроорганизмов». Особая значимость этого направления обусловлена наличием такого состояния у многих патогенных для человека микроорганизмов. В этом состоянии они как бы «невидимы» для стандартных методов диагностики. Кроме того, в этом состоянии у них увеличивается устойчивость к лекарственным препаратам.

Второе направление - это выявление и изучение микроорганизмов непосредственно в природных образцах (лат. in situ , буквально - на месте ) путем прямого анализа их нуклеиновых кислот без предварительного получения чистых культур, как это делалось раньше. Это направление даже получило собственное название - метагеномика . Благодаря методам метагеномики, среди которых, кстати, некоторые основаны на использовании флуоресцентных репортеров, появилась возможность по-новому оценить биологическое разнообразие микроорганизмов в отдельных экосистемах и на Земле в целом. Вот так «незатейливые» репортажи двух флуоресцентных репортеров способствовали появлению двух важнейших направлений исследований в современной микробиологии.

Итак, флуоресцентные репортеры сегодня представляют собой большую армию разнообразных «специалистов», которые уже имеют славную историю в экспериментальной биологии и медицине. Их флуоресцентные репортажи позволили лучше «разглядеть» те уголки микромира, куда может проникнуть свет. Причем разглядеть не только визуально, но и с точки зрения понимания физико-химических и биологических закономерностей. И все же исследователи, работающие в области разработки и применения этих «молекулярных помощников» изучения микромира, считают, что это только начало!

Видеозапись 5-го семинара Совета молодых ученых Института биоорганической химии РАН: «Технология акустической фокусировки частиц в проточной цитометрии »;

Липидный фундамент жизни ;

Нано-pH-метр ;

По ту сторону дифракционного барьера: Нобелевская премия по химии 2014 ;

Пучков Е.О. (2014). Флуоресцентные репортеры и их репортажи . Химия и Жизнь № 9 (2014) , 8–13. .

Классификация электронных переходов

Диаграмма Яблонского

Физические процессы, протекающие в электронно-возбужденном состоянии молекул, принято представлять в виде диаграммы Яблонского. Основными безызлучательными процессами дезактивации нижнего возбужденного состояния S 1 являются внутренняя конверсия (переход между состояниями одинаковой мультиплетности) и интеркомбинационная конверсия (переход между состояниями разной мультиплетности, например, синглет-триплетный переход S 1 ®T 1 ). Внутренняя конверсия S 1 ®S 0 – сравнительно медленный процесс. Поэтому в возбужденном состоянии S 1 могут наблюдаться процессы спонтанного испускания фотона (спонтанное излучение) и фотохимические реакции. Излучательными процессами являются разрешенная по спину флуоресценция и запрещенная по спину фосфоресценция.

Электронные спектры поглощения в УФ и видимом диапазонах, дают важную информацию о структуре и свойствах электронно-возбужденных состояний молекул. Знание спектра поглощения вещества является обязательным условием фотолюминесцентных и фотохимических исследований. Кратко остановимся на классификации электронных переходов

Электроны в органической молекуле располагаются на молекулярных s-, p- и n -орбиталях. На каждой молекулярной орбитали помещаются два электрона, отличающихся спинами. При возбуждении молекулы светом происходит переход электрона с занятой связывающей орбитали на свободную разрыхляющую орбиталь. Такие переходы обозначают в соответствии с их орбитальной природой: s-s*, n -s*, p-p* и n -p*.

Полосы поглощения, обусловленные переходами s®s* , находятся преимущественно в вакуумной УФ области < 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.

Переходам n -s* соответствуют полосы поглощения в УФ области. Например, органические соединения, содержащие n -электроны, локализованные на орбиталях гетероатомов, О, N, S, поглощают УФ свет в области около 200 нм.

Переходам p®p* и n ®p* соответствуют полосы поглощения в средней УФ-области. При сопряжении кратных связей полосы, обусловленные этими переходами, смещаются в ближнюю УФ- и видимую область спектра. Переходы n ®p* характерны для соединений, содержащих такие хромофорные группы, как С=О, C=S, N=N; эти переходы часто оказываются запрещенными, и соответствующие им полосы поглощения имеют сравнительно низкую интенсивность.

Эта классификация пригодна в основном для относительно простых молекул. В сложных молекулах определенный вклад в электронный переход могут вносить электроны, находящиеся на орбиталях разного типа.

Значительный интерес представляют электронные переходы с переносом заряда. Если в молекуле имеются электронодонорная и акцепторная группы, и они находятся в p-электронном сопряжении, то переход S 0 ®S 1 может сопровождаться переносом заряда от донора к акцептору по цепи сопряжения, как например, в данном стириловом красителе:

В этом случае говорят об электронном переходе с внутренним переносом заряда . Соответствующие полосы поглощения обычно характеризуются высокой интенсивностью и располагаются в видимой, а иногда и в ближней ИК области.

Для слабосвязанных органических донорно-акцепторных комплексов могут наблюдаться полосы поглощения, относящиеся к электронному переходу с переносом заряда от донора к акцептору через пространство (межмолекулярный перенос заряда ). Такие комплексы часто называют комплексами с переносом заряда. Длинноволновые полосы поглощения таких комплексов имеют сравнительно низкую интенсивность и могут находиться в ближней УФ, видимой и ближней ИК области спектра.

В металлорганической химии различают полосы поглощения, соответствующие переносу заряда от лиганда к металлу (ПЗЛМ ) и от металла к лиганду (ПЗМЛ ).

Люминесценция возникает после поглощения света и представляет собой излучательный переход из электронно-возбужденных состояний в основное состояние. В зависимости от природы основного и возбужденного состояний люминесценцию можно разделить на два типа. Как известно, спины электронов, один из которых находится в основном синглетном состоянии, а второй в возбужденном синглетном состоянии имеют противоположную ориентацию (спины электронов спарены). Переход электрона из возбужденного синглетного состояния в основное синглетное состояние квантовомеханически разрешен, поскольку в этом случае изменение ориентации спина не должно происходить. Иная ситуация наблюдается для триплетного состояния, в котором спин электрона имеет туже ориентацию, что и спин электрона в основном синглетном состоянии. Поэтому при переходе электрона из триплетного состояния в основное синглетное состояние необходимо изменение ориентации спина электрона. А данный процесс квантовомеханически запрещен.

Очевидно, что для этих двух типов переходов электронов должны существенно различаться величины скоростей испускания. Действительно, для квантовомеханически разрешенных синглет-синглетных переходов типичные величины скоростей испускания ~ 108 с-1, что соответствует временам затухания свечения ~ 10-8 с. Данный тип люминесценции и получил называние флуоресценция. Второй тип люминесценции называется фосфоресценцией - и представляет собой испускание, происходящее при переходе между состояниями различной мультиплетности, как правило из возбужденного триплетного состояния в синглетное состояние. Поскольку данные переходы квантовомеханически запрещены, то типичный диапазон времени затухания фосфоресценции колеблется от микросекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации энергии электрона в возбужденном состоянии. Таким образом, в зависимости от длительности послесвечения люминесценцию можно разделить на флуоресценцию и фосфоресценцию.

Процессы поглощения и испускания света безотносительно к изменению ядерных координат можно наглядно продемонстрировать с помощью диаграммы Яблонского (см. рис. 1).

Рис. 1. Диаграмма Яблонского, иллюстрирующая энергетические уровни
молекулы и скорости переходов. Прямые линии - радиационные переходы,
волнистые - безызлучательные переходы

Основное синглетное состояние, первое и второе возбужденное синглетные состояния обозначим S0, S1, S2 соответственно. Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных подуровней, а те в свою очередь состоят из множества вращательных подуровней (не показаны на рис. 1).

В соответствии с распределением Больцмана, при комнатной температуре большинство молекул находятся на самом нижнем колебательном уровне основного синглетного состояния S0. Именно такие молекулы преимущественно и будут погло-
щать излучение.

Итак, возбуждение как правило происходит из основного синглетного состояния S0 на различные колебательные уровни возбужденных синглетных состояний Sn (n = 1, 2, …). Переходы между различными подуровнями показаны прямыми линиями. Такое представление используется для того, чтобы показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происходит за время порядка периода световых колебаний, т.е. примерно за 10-15 с. За это время ядра не претерпевают заметного смещения (принцип Франка - Кондона).

Далее для молекул в конденсированной фазе наиболее вероятным процессом является их переход из возбужденных синглетных состояний на самый нижний колебательный уровень возбужденного состояния S1 за счет быстрых безызлучательных переходов (внутренняя конверсия) за время порядка фемтосекунд. Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10-8 с, то внутренняя конверсия обычно заканчивается до момента акта испускания. Поэтому, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденного состояния.

Обратный излучательный переход электронов (флуоресценция), аналогично акту поглощения, может происходить на различные колебательные уровни основного синглетного состояния S0 со скоростью Kф. После чего происходит их безызлучательная дезактивация на основной колебательный уровень за времена порядка 10-12 с.

Молекулы в состоянии S1 могут подвергаться и другим переходам. Например, возможен безызлучательный переход (внутренняя конверсия) в состояние S0 со скоростью Kвк, безызлучательная передача энергии соседним молекулам со скоростью Kпэ. Кроме того, молекулы в состоянии S1 могут также подвергаться интеркомбинационной конверсии в первое триплетное состояние Т1 со скоростью Kикк. Далее возможен излучательный переход молекулы из триплетного состояния в основное синглетное (фосфоресценция). Однако, как было сказано ранее такой переход квантовомеханически запрещен, в результате чего константа скорости для фосфоресценции на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции.

Сумма всех кинетических скоростей обратно пропорциональна времени жизни τ возбужденного состояния S1, т.е.:

Отношение представляет собой квантовый выход флуоресценции. На испускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, например, тушение люминесценции, влияние растворителя и др.

ГЛАВА 1.

Введение в флуоресценцию

Люминесценция - испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний - делится на два типа в зависимости от природы основного и возбужденного состояний , В синглетном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Гово­рят, что эти электроны спарены *. В триплетном состоянии эти электроны не спарены, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо при переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние. Флуоресценция - это испускание, происходящее при возвращении спаренно­го электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически "разрешены", а типичные величины скоростей испускания для них ~10 8 с -1 . Высокие значения скоростей испускания приводят к временам за­тухания флуоресценции~10 -8 с (10 нс). Время жизни - это средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Фосфоресценция - это испускание, происходящее при переходе между состояниями различной мультиплетности **, как правило, из возбужденного триплетного состояния в синглетное основное. Такие переходы не разреше­ны, и константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции - от миллисекунд до секунд, что главным обра­зом зависит от вклада других процессов дезактивации. В данной книге повсюду мы в первую очередь будем рассматривать более быстрый процесс флуоресценции.

В веществах, проявляющих значительную флуоресценцию, электроны в основном делокализованы и формально расположены на сопряженных двойных связях.

*Правильнее было бы сказать, что спины этих электронов спарены. Спаренны­ми обычно называют электроны, находящиеся на одной и той же орбитали, - Прим. Ред.

** Мультиплетностью состояния называют величину т= 2s + 1, где s - суммар­ный электронный спин данного состояния. Так, для синглетных состояний т= 1 и s = 0, для триплетных - т= 3 и s = 1 - Прим.ред.

Структуры некоторых типичных флуорофоров представлены на рис. 1.1. Одним из широко распространенных флуорофоров является хинин, который добавляют в тонизирующие напитки. Если посмотреть на стакан тоника, выставленного на солнечный свет , часто можно увидеть слабое го­лубое свечение. Оно наиболее заметно, если на стакан смотреть под прямым углом к направлению солнечного света, а также, если диэлектрическая пос­тоянная уменьшена благодаря присутствию добавок. Хинин, возбуждаемый ультрафиолетовым излучением солнца, при возвращении в основное состоя­ние испускает голубой свет с длиной волны около 450 нм. Явление флуо­ресценции часто может быть обусловлено некоторыми добавками. Напри­мер, зеленое или красно-оранжевое свечение, наблюдаемое иногда в анти­фризе, вероятно, вызвано следовыми количествами флуоресцеина или род­амина соответственно (рис. 1.1). Многоядерные ароматические углеводоро­ды, такие, как антрацен или перилен, также флуоресцируют, чем может частично определяться голубая флуоресценция бензина. И наконец, сильно флуоресцируют такие соединения, как РРО и РОРОР, используемые в "сцинтилляционных" растворах и биохимических исследованиях. Другие примеры будут даны в книге со ссылками на полезные свойства индивиду­альных флуорофоров. В отличие от молекул органических ароматических соединений атомы* в основном не флуоресцируют в конденсированной фазе.

РИС. 1.1. Структуры типичных флуоресцирующих соединений.

РИС. 1.2. Спектры поглощения и испускания флуоресценции перилена и хинина (по данным ).

Спектры испускания не могут быть правильно изображены одновременно в шка­ле длин волн и в шкале волновых чисел. В данном случае использовано правильное изображение в шкале волновых чисел. Длины волн приведены для удобства (см. гл. 2).

Единственным заметным исключением является группа элементов, обычно называемых лантаноидами [ 1]. Флуоресценция ионов европия и тербия выз­вана переходами электронов между f -орбиталями, которые экранированы от растворителя более высокими заполненными орбиталями.

Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции - это зависимость интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чисел (в см -1). Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены на рис , 1.2. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от хими­ческой структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор растворен. Спектры некоторых соединений, таких, как перилен, име­ют четкую структуру, обусловленную отдельными колебательными уров­нями энергии основного и возбужденного состояний *. Другие соединения, такие, как хинин, имеют спектры без колебательной структуры.

*Колебательная структура спектров испускания определяется колебательными подуровнями основного, а не возбужденного электронного состояния (подробнее см„ ниже). - Прим.. peд,

1.1. Диаграмма Яблонского

Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уров­ней энергии, предложенная Яблонским [ 3], Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S 0 , S, и S 2 соответственно (рис. 1.3), Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебатель­ных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Влияние раство­рителя во внимание не принимается, оно будет подробнее рассмотрено в гл. 7. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется , чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происхо­дит примерно за 10 -15 с, время, слишком короткое для заметного смеще­ния ядер (принцип Франка - Кондона).

Энергетическая щель между различными колебательными уровнями энергии видна из спектра испускания перилена (см. рис. 1.2). Отдельные максимумы испускания (а следовательно, и колебательные уровни энергии) отстоят друг от друга примерно на 1500 см -1 . Относительное число мо­лекул перилена, находящихся в колебательных состояниях 0 и 1, описыва­ется распределением Больцмана:

Отношение R числа молекул в двух сос­тояниях с разностью энергий Е дается выражением

R = e -  E/kT (1.1)

где k - константа Больцмана; Т - абсолютная температура, К. При ком­натной температуре 300 К отношение R равно~0,01. Следовательно, боль­шинство молекул будет находиться в самом нижнем колебательном сос­тоянии; именно такие молекулы и поглощают свет.

РИС. 1.3. Диаграмма Яблонского.

Из-за большой разнос­ти энергий между уровнями S 0 и S 1 по существу, ни у каких флуорофоров состояние S 1 не может быть заселено термическим путем. Интересно от­метить, что даже малое термически активированное заселение первого возбужденного колебательного состояния молекул можно зарегистрировать, используя различие спектров поглощения при разных температурах.

За поглощением света обычно следует несколько других процессов. Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого высшего колебательного уровня состояний (S 1 либо S 2). 3а некоторыми редкими ис­ключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая релаксация на самый нижний колебательный уровень состояния S 1 . Этот процесс называется внутренней конверсией и происходит большей частью за 10 -12 с. Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10 -8 с, внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до про­цесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденного состояния. Аналогично поглощению обратный переход электронов на самый нижний электронный уровень также приводит к колебательно возбужденному сос­тоянию (рис. 1.3). Термическое равновесие достигается за время порядка 10 -12 с. Интересным следствием из такого рассмотрения является то, что спектр поглощения молекулы отражает колебательную структуру возбуж­денных электронных состояний, а спектр испускания - колебательную струк­туру основного электронного состояния. В большинстве случаев электрон­ное возбуждение не сильно изменяет расположение колебательных уровней энергии. В результате этого колебательные структуры, проявляющиеся в спектрах поглощения и испускания, сходны.

Молекулы в состоянии S 1 могут также подвергаться конверсии в пер­вое триплетное состояние Т 1. Испускание из Т 1 называемое фосфоресценцией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из S 1 в Т 1 называется интеркомбинационной конверсией . Переход из Т 1 в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции. На ис­пускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, не показанные в явном виде на рис. 1.3: влияние растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях. Все они будут рассмотрены детально в последующих разделах книги.
1.2 Характеристики испускания флуоресценции

Для явления флуоресценции известно несколько основных характе­ристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из ниже­ перечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения,

1.2.1. Стоксов сдвиг

Как правило, всегда наблюдается сдвиг испускания относительно пог­лощения в сторону больших длин волн, т.е. потеря энергии (исключение - атомы в газовой фазе). Это явление впервые наблюдал Стоке в 1852 г. в Кембридже [ 4], используя при этом аппаратуру , принцип действия которой изображен на рис. 1.4. Источником ультрафиолетового возбуждения слу­жил солнечный свет, пропущенный через пластинку из голубого стекла. Пе­ред приемником в качестве желтого фильтра стоял стакан с вином, Флуоресценция хинина лежит в области 450 нм и поэтому хорошо заметна невоору­женным глазом. В настоящее время для определения величины стоксова сдвига используют другие методы.

Потери энергии между возбуждением и испусканием неизменно наблю­даются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень состояния S 1 . К тому же обычно происходит переход на возбужденные колебательные уровни состояния S 0 (см. рис. 1.3), что приводит к дополнительной потере колебательной энергии.

РИС. 1.4. Схема первой установки для обнаружения стоксова сдвига.

Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влия­ниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях. В газовой фазе у атомов и молекул не всегда имеется стоксов сдвиг. Испускание без сдвига наблюдают тогда, когда концентрации газа доста­точно малы для того, чтобы возбужденные молекулы не претерпевали столкновений с другими молекулами до процесса испускания. Такие стол­кновения приводят к релаксации. В жидкой фазе процессы соударения про­исходят непрерывно.
1.2.2, Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения

Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния.S 1 . Эта релаксации про­исходит за время порядка 10 -12 с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания. Существуют исключения (например азулен), когда испускание может происходить как из S 2 -, так и из S 1 -состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ве­дет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обус­ловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно воз­можно для тех флуорофоров , которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем.

1,2.1 Правило зеркальной симметрии

Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зер­кальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу изS 0 в S 1. Это особенно наглядно в случае перилена (см. рис. 1.2). Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены одними и теми же перехода­ми, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний S 0 и S 1 . Для многих молекул различное распределение электронов в сос­тояниях S 0 и S 1 существенно не влияет на эти уровни энергии. Согласно принципу Франка - Кондона, все электронные переходы происходят без из­менения межъядерного расстояния. В результате, если данная вероятность перехода (фактор Франка - Кондона) между нулевым и вторым колебатель­ными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход будет наиболее вероятен также и в испускании (рис. 1.5).

РИС. 1.5. Правило зеркальной симметрии и факторы Франка - Кондона.

Необходимым условием для зеркальной симметрии является представ­ление спектров поглощения и испускания в соответствующих единицах. Наи­лучшая симметрия должна существовать между модифицированными спек­трами (v)/v и F(v)/v 3 , где  (v) - коэффициент поглощения, соответствую­щий волновому числу v, a F(v) - относительный поток фотонов в интерва­ле волновых чисел Δ v [ 5]. Соответствие между такими спектрами обычно наблюдается для полиядерных ароматических углеводородов.

Несмотря на то, что правило зеркальной симметрии часто выполняет­ся, из него существует множество исключений. В качестве примера на рис. 1.6 приведены спектры флуоресценции дифенила. В спектре испуска­ния видна колебательная структура, которая отсутствует в спектре погло­щения. Такое отклонение от правило зеркальной симметрии обычно указы­вает на различное геометрическое расположение ядер в основном и возбужденном состояниях.

РИС. 1.6. Спектры поглощения и испускания дифенила.

Смешение ядер может произойти до процесса ис­пускания из-за относительно большого времени жизни состояния S 1 . В слу­чае дифенила, вероятно, отдельные кольца становятся более копланарными в возбужденном состоянии, в результате чего спектр испускания становит­ся более структурированным по сравнению со спектром поглощения. Дифенил не только представляет собой пример отклонения от правила зеркаль­ной симметрии, он необычен еще и тем, что его спектр испускания имеет более четко выраженную колебательную структуру, чем спектр поглощения. Обычно наблюдается противоположная картина.

Кроме геометрических перегруппировок отклонение от правила зеркальной симметрии могут вызвать также реакции в возбужденных состояниях. Так, например, для фенола и тирозина наблюдается по две полосы испускания, причем длинноволновое испускание более заметно при высоких концентрациях акцепторов протона (см, рис, 11,18). Величина рК а фенольной гидроксильной группы уменьшается от 11 в основном состоянии до 4 в возбужденном состоянии.

РИС. 1.7. Спектры испускания пирена и его эксимера (по данным ).

Относительная интенсивность в максимуме флуоресценции эксимера (470 нм) уменьшается при понижении концентрации пирена от 6x10 - 3 М (верхняя кривая) до 0,9x10 -1 М (нижняя кривая).
Вслед за возбуждением фенольный протон переходит к акцепторам про­тона в растворе. В зависимости от концентрации этих акцепторов в спектре испускания может преобладать флуоресценция либо фенола, либо фенолята. Примечательно то, что, даже несмотря на отсутствие активных групп, мно­гие полиядерные ароматические углеводороды также вступают в реакции в возбужденных состояниях. Так, например, молекулы пирена в возбужденном состоянии объединяются в комплексы , называемые эксимерами (сокращение от excited dimers - возбужденные димеры). Испускание эксимеров смешено в длинноволновую область по сравнению с испусканием мономеров пирена, в нем отсутствует колебательная структура (рис.1.7), Такие полиядерные ароматические углеводороды, как пирен, перилен и антрацен, образуют с ами­нами комплексы с переносом заряда. Комплексы, образующиеся в возбужден­ном состоянии, называют эксиплексами.
1.3. Времена затухания и квантовые выходы флуоресценции

Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирую­щих соединений. Смысл этих параметров хорошо виден из модифицированной диаграммы Яблонского (рис. 1.8). На этой диаграмме мы не указываем по­дробно отдельные процессы релаксации, приводящие к релаксированному состоянию S 1 , а обращаем большое внимание на процессы, которые ответст­венны за возвращение в основное состояние. В частности, нас интересует константа скорости излучательной дезактивации флуорофора (Г) и константа скорости безызлучательной дезактивации в состояние S 0 (k).

Квантовый выход флуоресценции - это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных. Обе константы скорости Г и k соответствуют процессам уменьшения заселенности возбужденного состояния. Доля молекул флуорофора , которые дезактивируются с испусканием, а следовательно, и квантовый выход определяются выражением

Q = Г/(Г+k) (1.2)

Квантовый выход близок к единице в том случае, если константа скорости безызлучательной дезактивации много меньше константы скорости испуска­ния, т. е. k « Г. Заметим, что энергетический выход флуоресценции всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь. Для удобства мы сгруппировали все возможные процессы безызлучательной дезактивации в одну константу скорости k.

РИС. 1.8. Модифицированная диаграмма Яблонского.

Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Обычно время затухания флуоресцен­ции -10 нс, Для флуорофора, описываемого диаграммой Яблонского (рис. 1.8), время затухания равно

τ = 1/(Г +k) (1.3)

Необходимо помнить, что испускание флуоресценции - это случайный про­
цесс и не все молекулы испускают фотоны при t = τ. Время жизни - это
средняя продолжительность пребывания в возбужденном состоянии. В приме­
ре для одноэкспоненциального затухания, приведенном в гл. 3, 63% молекул гибнет за время t = τ, а 37 % - за время t > τ. Время жизни флуорофора в отсутствие безызлучательных процессов, называемое собственным временем жизни *,τ 0 , равно

τ 0 = 1/Г (1.4)

Отсюда вытекает обычное соотношение между квантовым выходом и време­
нем жизни:

Q= τ / τ 0 (1.5)

Квантовый выход и время жизни могут изменяться под действием лю­бых факторов, влияющих на константы скорости. Например, молекула может оказаться неспособной флуоресцировать из-за большой скорости внутренней конверсии либо малой скорости испускания. Сцинтилляторы обычно выбира­ют за их высокие квантовые выходы , которые являются результатом боль­ших значений Г. Им обычно соответствуют короткие времена жизни, поряд­ка 1 нс. Флуоресценция ароматических соединений, содержащих группы N0 2 , обычно слаба, в первую очередь из-за большой величины k. Переход триплет- синглет запрещен по симметрии, и константы скорости спонтанного испус­кания составляют ~10 3 с- 1 или меньше **. Поскольку значения k близки к 10 9 с- 1 , квантовые выходы фосфоресценции малы при комнатной температу­ре. Из уравнения (1.2) можно получить квантовые выходы фосфоресценции, равные 10 -6 .

*Правильнее называть его радиационным (излучательным) временем жизни. - Прим. ред.

**Автор приводит слишком большое значение k для внутримолекулярной безызлучательной дезактивации триплетных состояний, которая встречается редко - лишь для молекул, претерпевающих химические превращения (в частности, изомеризацию). Из-за спинового запрета безызлучательный интеркомбинационный переход Т 1 → S 0 для большинства молекул имеет константы скорости k 1.4. Анизотропия флуоресценции

Флуорофоры преимущественно поглощают те фотоны , электрические век­торы которых направлены параллельно моменту перехода флуорофора. Момент перехода имеет определенную ориентацию в молекуле флуорофора. В изотроп­ных растворах молекулы флуорофоров ориентированы случайным образом. При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются те моле­кулы флуорофора, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего света (см. разд. 5.2.1). Такое селективное возбуждение частично ориентированного набора флуоро­форов (фотоселекция) приводит к частично поляризованному испусканию флу­оресценции. Для каждого флуорофора моменты перехода для поглощения и испускания имеют фиксированную ориентацию, и угол между ними определя­ет максимальную измеряемую анизотропию r 0 , см. уравнение (5.20)]. Ани­зотропия (r) и поляризация (Р) флуоресценции выражаются уравнениями

(1.6), (1.7)

гдегде I || и I ┴ интенсивности флуоресценции вертикально (II) и горизонталь­но (┴) поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикаль­но поляризованным светом. Анизотропия и поляризация - это выражения од­ного и того же явления, поэтому их можно взаимозаменять, используя урав­нения (5.3) и (5.4). Некоторые факторы могут уменьшать измеряемую вели­чину анизотропии до значений ниже максимального. Самый распространен­ный из них - вращательная диффузия, которая происходит за время жизни возбужденного состояния и смещает испускающий диполь флуорофора. Из­мерение этого параметра дает информацию об относительном угловом сме­шении флуорофора в интервале между поглощением и испусканием. Перенос энергии возбуждения между флуорофорами также приводит к уменьшению анизотропии.

Предположим, что единственным существенным процессом, приводящим к уменьшению анизотропии, является вращательная диффузия. Тогда измеряемая анизотропия определится выражением

,

где r 0 - анизотропия, которая должна была бы измеряться в отсутствие вра­щательной диффузии, а φ - время корреляции для процесса диффузии, опре­деляемое как

φ =ηV/kТ (1.9)

где η - вязкость раствора ; k - константа Больцмана; Т - абсолютная темпе­ратура; V -объем вращающегося фрагмента. Рассмотрим белок с молеку­лярной массой 50 000. Поскольку удельный объем белков составляет 0,73 мл/г, можно легко подсчитать, что при 25° С в водном растворе (n = 0,00894 П) ожидаемое время корреляции составляет 13 нc для безводной сферы. Поскольку белки гидрагированы, фактическое время корреляции, по-видимому, должно быть больше. Однако существенным является то, что вре­мена вращательной корреляции для большинства белков сравнимы с типич­ными временами затухания флуоресценции. Поэтому результаты измерения анизотропии флуоресценции зависят от всех факторов, влияющих на скорость вращательной диффузии. По этой причине измерения поляризации флуорес­ценции широко используют для изучения гидродинамических свойств макро­молекул.

1.5. Временная шкала молекулярных процессов в растворе

Флуоресцентная спектроскопия - эффективный метод исследования ди­намических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Такая возможность связана в первую очередь с временем жизни возбужден­ных состояний. Вследствие принципа Франка - Кондона абсорбционная спек­троскопия может дать информацию только об усредненных характеристиках основного состояния молекул, поглотивших свет. Поскольку только те мо-иекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектро­скопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболоч­ке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекуляр­ную динамику.

В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов , протекающих за вре­мя жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участ­вовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до 100 А от флуорофора. Хотя может показаться, что 10 нс - слишком корот­кий промежуток времени, фактически это большое время по сравнению с временем движения малых молекул в жидком растворе. Вращательная диффу­зия связанных с белками и мембранами флуорофоров также укладывается в этот временной диапазон.

Тушение флуоресценции молекулярным кислородом по механизму стол­кновений является показательным примером размеров пространственного и временного диапазонов, представляемых временем затихания флуоресцен­ции. Если флуорофор, находящийся в возбужденном состоянии, сталкивает­ся с молекулой кислорода, он возвращается в основное состояние без испус­кания фотона. Коэффициент диффузии кислорода в воде при 25°С равен 2,5 10 -3 см 2 /с. Среднее расстояние [(Δх 2) 1/2 ], на которое может диффун­дировать молекула кислорода за 10 -3 с, определяется уравнением Эйнштейна:

Δ x 2 = 2Dτ (1.10)

Расстояние [ (Δх 2) 1/2 ] составляет ~ 70 Å, что сравнимо с толщиной биологи­ческой мембраны или диаметром белка. Для некоторых флуорофоров време­на жизни достигают 400 нc, поэтому можно наблюдать диффузию молекул кислорода на расстояния свыше 450 А. Напротив, измерения поглощения дают сведения лишь о непосредственном окружении флуорофора и, следова­тельно, о мгновенном усредненном окружении.

Влияние молекулярной динамики на спектры флуоресценции также обна­руживается при рассмотрении энергий. Органические молекулы, как правило, поглощают свет в диапазоне длин волн 200 - 500 нм, что соответствует энергиям от 140 до 60 ккал/ моль. Вслед за поглощением у флуорофора из­меняется (обычно возрастает) дипольный момент. Если молекулы растворителя также имеют дипольные моменты, они переориентируются во­круг диполя возбужденного состояния , понижая тем самым его энергию. Этот процесс называется релаксацией растворителя и происходит в жидких растворах за 10 -12 с. Релаксация растворителя может приводить к значи­тельным стоксовым сдвигам. В белках триптофановые остатки поглощают свет с длиной волны 280 нм, а испускают флуоресценцию при -350 нм. Таким образом, за несколько наносекунд, проходящих до процесса испус­кания, расходуется 20 ккал/моль.

В основе любого эксперимента лежат измерение некоторой величины и корреляция полученных результатов с явлением, представляющим интерес для исследователя. Временной диапазон между поглощением света и после­дующим его испусканием достаточен для протекания нескольких процессов, каждый из которых приводит к ослаблению наблюдаемых спектральных ха­рактеристик флуоресценции. К таким процессам относятся столкновения с тушителями, вращательная и поступательная диффузия, образование комп­лексов с растворителями или с растворенными веществами и переориента­ция окружения молекулы в возбужденном состоянии с измененным дипольным моментом. Эти динамические процессы могут влиять на анизотропию флуоресценции, квантовые выходы, времена жизни и спектры испускания. В результате спектральные характеристики флуорофоров могут дать большую информацию о динамических процессах, протекающих за время испускания флуоресценции.

1.6. Флуорофоры

1.6.1 Природные флуорофоры

Из большого числа молекул биологических веществ многие являются природными, или естественными, флуорофорами. Мы кратко суммируем ин­формацию о широко известных флуорофорах , что дает основу для последую­щих глав. Такое конспективное изложение не является исчерпывающим.

БЕЛКИ Триптафан - наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокисло­та в белках. Около 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено триптофановыми остатками. "Этот природный флуорофор крайне чувствителен к полярности окружающей среды. Спектральные сдвиги часто являются след­ствием нескольких явлений, среди которых можно выделить связывание лигандов, ассоциацию белок - белок и денатурацию. Кроме того, максиму­мы испускания белков отражают среднюю доступность их триптофановых остатков в водной фазе. Белки поглощают свет вблизи 280 нм, а максимумы спектров флуоресценции лежат в области 320 -350 нм. Времена затухания флуоресценции триптофановых остатков лежат в диапазоне 1-6 нс.

Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе, однако в белках его флу­оресценция значительно слабее. Денатурация белков обычно усиливает ис­пускание тирозина. Как и для фенола, рК а тирозина очень сильно уменьшает­ся при возбуждении, и может происходить ионизация в возбужденном состоя­нии.

нуклеиновые кислоты Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты обычно не флуоресцируют. Тем не менее существуют некоторые исключения. tRNA Phe из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирующее основание, известное как Y-основание, которое имеет максимум испускания вблизи 470 нм, а вре­мя жизни ~6 нc.

Кофакторы NADH флуоресцирует сильно, и максимумы его поглощения и испускания находятся при 340 и 450 нм соответственно. NAD + не флуорес­цирует. Время затухания флуоресценции NADH в водном буфере составля­ет примерно 0,4 нс. Флуоресцирующей группой является восстановленное никотинамидное кольцо, причем его флуоресценция частично потушена за счет столкновений с остатком аденина. При связывании NADH с белками квантовый выход его флуоресценции увеличивается обычно в четыре раза. Такое увеличение выхода обычно интерпретируют как следствие связывания NADH в вытянутой конформации, что подтверждается изучением дифракции рентгеновских лучей на гидрогеназах.

РИБОФЛАВИН И FAD. Рибофлавин, FMN (флавинмононуклеотид) и FAD (флавинадениндинуклеотид) поглотают свет в видимой области (-450 нм) и испускают в области 515 нм. Типичные времена жизни для FMN и FAD сос­тавляют 4,7 и 2,3 нс соответственно. Как и для NADH, флуоресценция флавина динамически тушится аденином. Далее, FAD также образует комплек-сымссоциаты , в которых флуоресценция флавнна потушена аденином (ста­тическое тушение). Флагопротеины в основном не флуоресцируют, однако опять же существуют исключения.

1.6.2. Искусственные фпуорофоры

Часто естественные флуоресцентные свойства макромолекул не позволя­ют получить из эксперимента желаемую информацию. Так, например, флуо­ресценция белка и даже поляризация этой флуоресценции не отражают явле­ние, которое хотят охарактеризовать количественно, В таком случае выби­рают флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют лучшие спектральные свойства,

ИЗОЦИАНАТЫ И ИЗОТИОЦИАНАТЫ ФЛУОРЕСЦЕИНА И РОДАМИНА. Эти краси­тели широко используют в качестве меток для белков. Меченные флуоресцеином иммуноглобулины - коммерческие реактивы; их часто используют в флуоресцентной микроскопии. Именно эти вещества выбирают из-за вы­соких квантовых выходов и устойчивости к фото обесцвечиванию. Кроме того, благодаря большим длинам волн поглощения и испускания (рис. 1,9) сведена к минимуму проблема фоновой флуоресценции биологических об­разцов и можно избежать применения кварцевой оптики. Изоцианатная или изотиоцианатная группы находятся либо в мета-, либо в параположении по отношению к карбокси-группе (см. рис, l.l). Коммерческие меченые реа­генты представляют собой смесь изомеров. Эти красители реагируют в первую очередь с лизиновым или цистеиновым участком белков. Времена затухания флуоресценции красителей около 4 нс, а их спектры испускания мало чувствительны к полярности растворителя. Эти красители очень под­ходят для количественного определения степени ассоциации небольших ме­ченых молекул с белками на основании изменения поляризации флуоресценции.

ДАНСИЛХЛОРИД. Дансилхлорид (DNS-C1) широко используют в качестве метки для белков (рис. 1.10), особенно в тех случаях, когда проводят изме­рения поляризации. Это вещество давно известно [ 8] и имеет удобное вре-ся жизни флуоресценции (~ 10 нс). На спектр испускания дансильной груп­пы сильно влияет полярность растворителя.

РИС. 1.9. Спектры возбуждения и испускания бычьего γ-глобулина. меченного зотиоцианатом флуоресцеина (по данным [ 7]).

РИС. 1.10. Часто используемые искусственные флуорофоры.

Нафтиламинсульфоновые кислоты, 1-Анилино-8-нафталинсульфоно-вяя кислота (l,8-AТS или ANS), 2-n-толуидинилнафталин-б-сульфоновая кислота (2,6-TNS или TNS) и их производные часто используют в качестве нековалентно связанных зондов для белков и мембран. Эти зонды почти не флуоресцируют в воде, но интенсивно флуоресцируют либо при растворении в неполярных растворителях, либо когда они связаны с макромолекулами. Низкий квантовый выход в водной фазе позволяет во многих случаях не учитывать эту часть флуорофора , что упрощает эксперименты. Подобные флуорофоры связываются с сывороточными альбуминами, липопротеинами, апомиоглобином, иммуноглобулинами и липидными бислоями. Места связывания имеют, по-видимому, кик полярную, так и неполярную природу.

Гидрофобные мембранные зонды. Липиды обычно не флуоресциру­ют. Мембраны часто метят такими зондами, как перилен, 9-винилантраЦен и 1,6-дифенилгексатриен (DРН) (рис. 1.10). Эти зонды нерастворимы в во­де и встраиваются в гидрофобные участки мембран. Незамещенные много­ядерные ароматические углеводороды и DPH малочувствительны к поляр­ности растворителя. Их используют в первую очередь для оценки внутрен­ней вязкости двойных слоев по измерениям поляризации их флуоресценции (разд. 5.7.1). Путем целенаправленного изменения химического строения зонды могут быть локализованы на избранных участках мембраны. Одним из таких примеров является триметиламмониевая соль DPH (ТМA-DPH). Полагают, что заряженный атом азота приводит к локализации ТМА-DPH в области липидно-водной границы мембран [ 14].

Другие зонды, как, например PATMAN (рис. 1.11), очень чувствитель­ны к фазовому состоянию липидных бислоев [ 9]. При температуре перес­тройки мембран спектр испускания PАTМAN сжигается на 40 нм в длинноволновую область: от 425 до 465 нм. По-видимому, этот зонд реагирует на релаксацию мембраны вокруг диполи возбужденного состояния флуорофора (разд. 8.6). Были предложены и другие зонды. Чувствительность к потенциалу мембраны может быть связана с изменением ориентации зонда или его локальной концентрации в мембране , а также с влиянием электри­ческого поля т электронное распределение в зонде [ 11]. И наконец, можно выделить зонды, которые подвергаются реакциям в возбужденном состоянии. В возбужденном состоянии зонд Р 2 -С 3 , может образовывать внутримоле­кулярный эксимер, и доля образовавшихся эксимеров определяет вязкость в их ближайшем окружении.

Нуклеиновые кислоты. При введении этиленового мостика флуорес­ценция АТР и его производных становится более интенсивной [ 12]. Такие производные ε-АТР (рис. 1.11) чувствительны к вязкости растворителя , имеют высокую предельную поляризацию флуоресценции, и времена затухания их флуоресценции близки к 23 нс. Нуклеотидные аналоги активны во многих реакциях, катализируемых ферментами. Кроме того, были синтези­рованы такие аналоги нуклеотидов с вытянутой конформацией, как лин-бен-зо-АМР, Эти аналоги флуоресцируют [ 13] и сохраняют способность к обра­зованию водородных связей не модифицированных нуклеотидов.

Подводя итоги, можно сказать, что флуоресценцией обладают разнооб­разные молекулы и на спектральные свойства флуорофоров влияет целый ряд факторов и процессов. Как следствие этого, флуоресцентные методы полез­ны для изучения свойств растворов и биологических макромолекул.

РИС. 1.11. Часто используемые искусственные флуорофоры.